KHV – Koi Herpes Virus

KHV er nok alle Forhandlere og Koi entusiasters værste fjende. Vi går konstant og er i risiko for at vores Koi pludselig skulle få et KHV udbrud.

KHV kan desværre ramme os alle. Der er dog tiltag og foranstaltninger der kan gøres og som vi hos KoiOasen betragter som at være en, pligt, som seriøs forhandler, at gøre for vores kunder sikres bedst muligt. Alle fisk SKAL PCR testes og gennemgå et karantæneforløb. Ingen nye fisk kommer hjem i salgsbassiner før vi har sikret os bedst muligt “Din sikkerhed for kvalitet”

Hvert år er der Forhandlere som private der rammes af KHV. Hertil kan der være mange årsager som bla. nævnes i den lånte artikel nedenfor. Faktum er bare, at vi vil opfordre alle til at gøre hvad gøres kan for at undgå smitten, ja lad vores fisk teste, men næst er, lad os være ærlige og åben omkring KHV hvis man er blevet smittet, sådan smitten kan inddæmres til det minimale. Alt andet er, i vores optik, mangel for respekt og ganske useriøst.

Fakta fra den virkelige verden:

Tilbage i 2018. Hvor jeg (Jesper Andersen) var alm. Koi hobbyist. Jeg var endnu ikke startet som Forhandler. Jeg købte til tider en nedlagt dam for at bygge min egen op med de fisk jeg nu ønskede, dem jeg ikke ville have solgte jeg på nettet. Dette er ikke anderledes end så mange andre hobbyister. Der sker så pludselig det, at en køber, efter 4 uger, får sygdom blandt hans fisk. Vedkommende søger hjælp og råd og det får han så godt som jeg kunne. Ugerne går og dyrelæge er vedkommende behjælpelig. Da vedkommendes fisk dør i stor stil, tilkaldes dyrelægen igen og samme dag kommer Fødevarestyrrelsen da der konstateres KHV. Når sådan konstateres, går det store apparat igen og Fødevarestyrrelsen påbegynder smitteopsporing.

Da jeg havde solgt nogle fisk til vedkommende 6-8 uger forinden KHV udbrud, betegnes jeg som mulig smittekilde. Når sådan sker kommer man under – offentlig tilsyn – dvs. at jeg intet må foretage mig hvad fisk angår. Det vil også sige, at Fødevarestyrrelsen og Dyrelæge kommer på besøg hos mig, her med henblik på at besigtige mine forhold samt, at udtage x-antal fisk som skal aflives grundet test af de indre organer. Husker ikke præcis men det var mange fisk der blev aflivet. Det apparat der blev sat igang, var ganske korrekt og det eneste rigtige at gøre da jeg jo faktisk var en potentiel smittespreder. KHV udbrud hus vedkommende blev konstateret den 20. september 2018. Dagen efter modtog jeg skrivelse om Offentlig tilsyn, dagen efter fik jeg besøg af Fødevarestyrrelsen og Dyrelæge.

At være potentiel smittespreder er ikke rart. Fra Fødevarestyrrelsen kontaktede mig og frem til et endeligt test resultat, der var jeg jo nærmest i en angstligende tilstand samtidig med at jeg havde det enormt dårligt med, at jeg jo faktisk kunne være årsag til at anden har fået KHV og mistet alle sine fisk. Ikke mindst, hvad så med de andre fisk jeg havde skilt mig af med. Der næst, så havde jeg selv mange fisk som nærmest var mit kæreste eje – har de også KHV – skal alle aflives. Bestemt ikke en oplevelse jeg ønsker skal ske for nogen overhovedet. Perioden den 20. september frem til den 2 oktober var et sendt marit.

Den 2 oktober modtager jeg en skrivelse fra Fødevarestyrrelsen – Dine fisk/koi Karper på overnævnt adresse blev den 21. september 2018. sat under offentlig tilsyn på grund af mistanke om smitte med Koi Herpes Vira (KHV). Fødevarestyrrelsen har nu modtaget svar der vider, at prøver fra dit karpehold er undersøgt for KHV med tilfredsstillende resultat. Derfor ophæver vi det offentlige tilsyn og de restriktioner, dit karpehold har været underlagt.

Guldske tak og lov. Jeg var mildest talt lykkelig og igen, så håber jeg ikke ligende vil ske for andre.

Siden min oplevelse, har jeg fået enorm respekt for KHV og køb af fisk der ikke er testet er total ophørt. Jeg tør ganske enkelt ikke. Risikoen er for stor. Alt sættes på spil.

Slutlig vil jeg opfordre alle til at være åben og årlige omkring KHV. Lad os hjælpe hinanden med at begrænse smitten til det minimum

Artikel lånt fra nettet:

KOI HERPESVIRUS SYGDOM 

1. Definition af sag 

Koi herpesvirus sygdom (KHVD) er en herpesvirus infektion (17) i stand til at fremkalde en smitsom og akut viraæmi i fælles karper (Cyprinus carpio) og sorter som koi karpe og spøgelse karper (15). 

2. Oplysninger om udformning af overvågningsprogrammer 

a) Agentfaktorer 

Det aetiologiske middel er koi herpesvirus (KHV) i familien Herpesviridae (17, 40), selv om det også har fået navnet karpe interstitiel nephritis og gillnekrosevirus (CNGV) (19, 28). Waltzek et al. (39) fremlagde dokumentation til støtte for klassificeringen af virus som herpesvirus og kaldte det cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3) efter nomenklaturen for andre cyprinid herpesvirus: CyHV-1 (karpepoxvirus, fisk papilloma) og CyHV-2 (guldfisk nekrotopoietisk nekrosevirus). Estimaterne af genomstørrelsen af KHV varierer fra mindst 150 kbp (11) til 277 kbp (19) til 295 kbp (39). Fire gener, der koder for en helicase, et intercapsomeric triplex protein, DNA polymerase og større capsidprotein, er blevet identificeret, og sekvensanalyse af disse gener har vist, at KHV er tæt forbundet med CyHV-1 og CyHV-2, og fjernt relateret til kanal havkat virus virus (Ictalurid herpesvirus: IcHV-1) (39). Skøn over virion størrelse varierer også. Nukleocapsids af negativ farvet virus er blevet målt til 103-112 nm diameter omgivet af en konvolut (17, 19, 37). Nukleokapslerne af tyndsektionet virus er blevet målt til 80- 110 og 110-120 nm i diameter (4, 17, 26). 

Serum fra koi karper indeholdende antistoffer mod KHV har vist sig at krydse- reagere med CyHV1, en yderligere indikation af, at disse vira er nært beslægtede. Der blev påvist tegn på krydsreakterende antistoffer i gensidig enzymrelateret immunosorbentanalyse (ELISA) og western blot-analyser af serum fra koi inficeret med CyHV-1 eller KHV (1). 

Sammenligninger af genomer af KHV isolater fra forskellige geografiske områder ved begrænsning enzym analyse (9, 15) eller nukleotid sekvens analyse (13, 20, 29) har vist dem at være praktisk talt identiske. På samme måde var polypeptider af KHV-isolater fra forskellige geografiske områder ens, selv om et isolate fra Israel havde to yderligere polypeptider (7, 9). 

Virusset inaktiveres af UV-stråling og temperaturer over 50 °C i 1 minut. Følgende desinfektionsmidler er også effektive til inaktivering: iodophore ved 200 mg/liter i 20 minutter, benzalkoniumchlorid ved 60 mg/liter i 20 minutter, ethylalkohol ved 30 % i 20 minutter og natriumhypochlorit ved 200 mg/liter i 30 sekunder, alt sammen ved 15 °C (21). 

b) Værtsfaktorer 

Naturligt forekommende KHV infektioner er kun blevet registreret fra fælles karper (Cyprinus carpio carpio), koi karper (Cyprinus carpio koi) og spøgelse karper (Cyprinus carpio goi) og hybrider af disse sorter. Alle aldersgrupper af fisk synes at være modtagelige for KHVD (4, 29, 36), men under forsøgsbetingelser var 2,5-6 g fisk mere modtagelige end 230 g fisk (26). Differensent mod KHVD har vist sig blandt forskellige fælles 

karpestammer (32) og andre undersøgelser har antydet en aldersrelateret resistens (26). Sygelighed af berørte populationer kan være 100%, og dødelighed 70-80% (4, 38), men sidstnævnte kan være så høj som 90 eller 100% (4, 37). 

Karper opdrættes ofte i polykultur med andre fiskearter, men der er ikke observeret tegn på sygdom eller dødelighed hos de andre fisk under KHVD-udbrud under normale polykulturforhold. Ildfast arter omfatter guldfisk (Carrassius auratus), græs karper (Ctenopharyngodon idellus), sølv karper (Hypophthalmichthys molitrix), tench (Tinca tinca), stør (Acipenser sp.) Nile tilapia (Oreochromis niloticus), sølv aborre (Bidyanus bidyanus) og kanal havkat (Ictalurus punkttatus) (4, 17, 26, 35). 

Sygdommen er temperaturafhængig, forekommer mellem 16-25 ° C (6, 17, 26, 29, 36, 37). Under forsøgsvilkår har sygdommen forårsaget høj dødelighed ved 28 °C (10), men ikke ved 29 eller 30 °C (19, 25) eller ved 13 °C (10). Imidlertid blev viralt DNA påvist i fisken ved PCR ved 13 °C, og det er muligt, at inficerede fisk, der overlever ved lave temperaturer, kan være reservoirer af viruset (10). Sygdomsforløbet kan være hurtigt. Sygdommen manifesterede sig i 3 dage efter tilsætning af naiv fisk til en dam, der indeholder syge fisk (38), men normalt under disse omstændigheder tager det 8- 21 dage for sygdommen at blive observeret i den naive fisk (4, 17). Det vides ikke, om overlevende fra KHVD under naturlige forhold er vedvarende inficeret med virus, og i bekræftende fald, om de mister virussen, eller hvor længe fisken bevarer virussen. Nogle af disse aspekter er blevet undersøgt i eksperimentelt inficerede fisk, hvor det blev påvist, at virus kunne fortsætte i almindelig karpe inficeret ved en eftergivende temperatur og efterfølgende opretholdes ved en lavere end eftergivende temperatur (33). 

Almindelige karper (Cyprinus carpio) stammer er i øjeblikket den eneste rapporterede vært for KHVD og derfor anses for at være mest modtagelige for KHV infektion. Guldfisk x almindelige karpehybrider, der produceres ved hybridisering af mandlige guldfisk med kvindelige karper, er blevet rapporteret at vise en vis modtagelighed for KHV-infektion. Ca. 50 % af disse hybrider blev undersøgt 25 dage efter intraperitoneal 

injektion med en høj dosis KHV i besiddelse af viral genomisk DNA, som detekteret af PCR (18). I modsætning til resultaterne andre steder tyder de seneste eksperimentelle data fra Tyskland på, at der er en følsomhed over for guldfisk og græskarpe for KHV, men der er behov for yderligere bekræftelse af disse resultater (14, 18). Ved prøveudtagning under overvågningsprogrammer for KHV bør almindelige karper eller stammer som koi eller spøgelse (koi × almindelig) karper fortrinsvis udvælges efterfulgt af almindelige karpehybrider, der findes på stedet, såsom guldfisk × fælles karper. Cyprinid arter er almindeligt blandet sammen i polykultur systemer og risikoen for overførsel af virus mellem arter, under sygdomsudbrud, er høj. Hvis resultaterne fra Tyskland blev bekræftet, skulle alle cyprinidarter af hensyn til sygdomsovervågning betragtes som potentielle hemmelige bærere af KHV. 

KHVD’s reservoirer er klinisk inficerede fisk og skjulte virusbærere blandt dyrkede, vildtlevende eller vilde fisk. Virulent virus kastes via fæces, urin, gælle og hud slim. Gill, nyre og milt er imidlertid de organer, hvor KHV er mest rigelig i løbet af åbenlys infektion (10). 

Overførselsmåden for KHV er vandret, men »æg-associeret« transmission (normalt kaldet »lodret« transmission) kan i øjeblikket ikke udelukkes. Horisontal transmission kan være direkte (fisk til fisk) eller vectorial, vand er den største abiotiske vektor. Animere vektorer (f.eks. parasitære hvirvelløse dyr og piscivorøse fugle og pattedyr) og fomitter kan dog også være involveret i transmission. 

c) Sygdomsmønster 

Sygdomsmønstre påvirkes af vandtemperatur, virulens af virus, fiskens alder og tilstand, befolkningstæthed og stressfaktorer. Fiskens immunstatus vil også være en vigtig faktor med både ikke-specifik (interferon) og specifik immunitet (serum antistoffer, cellulær immunitet), der har vigtige roller i herpesvirusinfektioner. Klinisk sygdom dominerer ved vandtemperaturer over 18 °C, når værtsimmunitetsresponset er optimalt. Inficerede karper producerer antistoffer mod virus, 

som er påvist ved ELISA-metoder ved høj serumfortynding. Der er påvist antistof i serumet 3 uger efter eksperimentel infektion og hos overlevende efter 1 år efter en naturlig infektion (1, 28, 33). Sekundære og samtidige bakterielle og/eller parasitære infektioner ses almindeligvis i syge karper og kan påvirke dødeligheden og visning af tegn (15). 

Efter de første rapporter om KHVD i Israel og Tyskland (4, 16, 26) er sygdommens geografiske rækkevidde blevet omfattende. Sygdommen er blevet spredt til mange lande verden over, hovedsagelig gennem handel med Koi karpe før den nuværende viden om sygdommen og midler til at opdage det var til rådighed. Det er nu kendt for at forekomme i, eller er blevet registreret i fisk importeret til mindst 21 forskellige lande. I Europa omfatter dette Østrig, Belgien, Danmark, Frankrig, Italien, Luxembourg, Nederlandene, Polen, Schweiz og Det Forenede Kongerige (3, 6, 15, 30). I Asien, Kina (Hong Kong) (15), Indonesien (35), Japan (29), Malaysia (15, 22, 23), Singapore (i fisk importeret fra Malaysia), Taipei Kina (37) og Thailand (i fisk importeret til Tyskland, 15). Andre steder har Sydafrika (15) og USA (11, 16, 36) rapporteret om forekomsten af KHVD. Det er sandsynligt, at virussen er til stede i mange flere lande, men er endnu ikke blevet identificeret der eller rapporteret. 

d) Kontrol og forebyggelse 

Metoder til bekæmpelse af KHVD bør primært være afhængige af at undgå eksponering for virus kombineret med god hygiejne- og biosikkerhedspraksis. Dette er muligt på små gårde, der leveres af kilde- eller borehulsvand, og et sikkert system til at forhindre fisk i at komme ind på gården via udledningsvandet. Biosikkerhedsforanstaltninger bør også omfatte sikring af, at nye introduktioner af fisk kommer fra sygdomsfrie kilder, og et karantænesystem, hvor der holdes nye fisk med skildfisk ved eftergivende temperaturer for KHVD. Fisken er derefter i karantæne i mindst 4 uger til 2 måneder før overførsel til hovedstedet og blanding med naiv fisk. Hygiejneforanstaltninger på stedet bør svare til dem, der anbefales til SVC, og omfatte desinfektion af æg ved iodophore 

behandling (21), regelmæssig desinfektion af damme, kemisk desinfektion af landbrugsudstyr, omhyggelig håndtering af fisk for at undgå stress og sikker bortskaffelse af døde fisk. 

I opdrætsfaciliteter med et kontrolleret miljø kan højde af vandtemperaturen over 26-28 °C reducere dødelighed under KHVD-udbrud (7, 28). Sænkning af belægningsgraden og behandling af sekundære infektioner kan også bidrage til at reducere sværhedsgraden af sygdommen (35) En sikker og effektiv vaccine er i øjeblikket ikke bredt tilgængelig. Men svækket virus er blevet brugt til at vaccinere karper og beskytte fiskene mod virus udfordring (25, 28). Vaccinepræparatet fremkaldte antistof mod virusset, men varigheden af beskyttelsen er ukendt. Vaccinen er i øjeblikket licenseret til brug i Israel og har været meget udbredt i karpefarme over hele landet. 

3. Diagnostiske metoder 

Diagnose af KHVD i klinisk ramte fisk kan opnås ved virusisolation. Virussen er dog kun isoleret i et begrænset antal cellelinjer, og disse celler kan være vanskelige at håndtere. Cellekulturisolation er heller ikke så følsom som de offentliggjorte PCR-baserede metoder til at opdage KHV DNA og anses ikke for at være en pålidelig diagnostisk metode til KHVD (15). Immundiagnostiske metoder, svarende til dem, der anvendes til diagnosticering af SVC (f.eks. immunofluorescencetests eller ELISA’er), kan være egnede til hurtig identifikation og diagnosticering af KHVD, men er ikke blevet grundigt rapporteret, sammenlignet eller valideret. Indtil validerede tests foreligger, bør diagnosen KHVD ikke kun baseres på én test, men en kombination af to eller tre tests (15). 

KHV-infektion producerer et påviseligt antistofrespons hos karper og enzymimmunassayer, der pålideligt registrerer, at disse antistoffer er blevet offentliggjort (1, 28). Disse metoder kan anvendes som hurtige formodede test under den akutte sygdom, men forskellige parametre, såsom antistoffølsomhed og 

specificitet og prøveforberedelse, kan påvirke resultaterne, og derfor bør et negativt resultat ses med forsigtighed. 

Påvisning af antistoffer kan vise sig at være en værdifuld metode til at fastslå tidligere eksponering for KHV i tilsyneladende sunde fisk, og indtil PCR-baserede metoder er blevet udviklet, der er i stand til pålideligt at opdage vedvarende virus i eksponerede fisk, antistof assays kan være den eneste overvågning værktøjer til rådighed. På grund af utilstrækkelig viden om fiskens serologiske reaktioner på virusinfektioner er påvisning af fiskeantistoffer mod vira imidlertid hidtil ikke blevet accepteret som en rutinemæssig screeningsmetode til vurdering af fiskebestandenes virale tilstand. I den nærmeste fremtid kan der opstå validering af visse serologiske teknikker til visse fiskevirusinfektioner, hvilket gør brugen af fiskesynologi mere generelt acceptabel til sundhedsscreening. 

Fiskemateriale, der er egnet til virologisk undersøgelse, er: 

• • Asymptomatisk fisk (tilsyneladende sund fisk): Gill, nyre, milt og encephalon (enhver størrelse fisk). 
• • Klinisk påvirket fisk: Gill, nyre, milt, tarm og encephalon (enhver størrelse fisk). 

a) Feltdiagnosticeringsmetoder 

Under et KHVD-udbrud vil der være en mærkbar stigning i dødeligheden i befolkningen. Alle aldersgrupper af fisk synes at være modtagelige for KHVD, selv om yngre fisk op til 1 år generelt er mere modtagelige for klinisk sygdom. Fisk bliver sløve, adskilt fra stimerne og samles ved vandindtaget eller siderne af en dam og gisper ved vandets overflade. Nogle fisk kan opleve tab af ligevægt og desorientering, men de kan også vise tegn på hyperaktivitet. Ved nærmere undersøgelse af individuelle fisk omfatter typiske kliniske tegn bleg misfarvning eller rødme af huden, som også kan have en grov tekstur, fokal eller totalt tab af epidermis, over- eller underproduktion af slim på huden og gællerne. Andre grove tegn omfatter enophthalmia (sunkne øjne) og blødninger på huden og bunden af finnerne og fin erosion. 

b) Kliniske metoder 

Der er ingen patognomiske bruttolæsioner. Endelig diagnose skal afvente direkte påvisning af viralt DNA eller antigen i væv eller virusisolation og identifikation. Men den mest konsekvente bruttopatologi ses i gællerne, og dette kan variere i omfang fra blege nekrotiske pletter til omfattende misfarvning, alvorlig nekrose og betændelse. Yderligere undersøgelse kan afsløre erosion af primær lameller, fusion af sekundær lameller, og hævelse på spidsen af den primære og sekundære lameller. Andre indre læsioner er variable i forekomst og ofte fraværende i tilfælde af pludselig dødelighed. Andre grove patologier, der er blevet rapporteret omfatter vedhæftninger i bughulen med eller uden unormal farvning af indre organer (lysere eller mørkere). Nyrerne eller leveren kan forstørres, og de kan også udvise petechial eller fokal blødninger. 

Tilstedeværelsen af grove patologier kan også være kompliceret, fordi syge fisk, især almindelige karper, også er inficeret med ektoparasitter som Argulus sp., Chilodonella sp., Cryptobia sp., Dactylogyrus sp., Gyrodactylus sp., Ichthyobodo sp., Ichtyophthirius sp., Trichodina sp. og gill monogeneanere samt mange arter af bakterier. 

Den histopatologi af sygdommen kan være ikke-specifikke og variable, men betændelse og nekrose af gill væv er en konsekvent funktion. Gills også udviser hyperplasi og hypertrofi af branchial epitel, og fusion af sekundære lameller og vedhæftning af gill filamenter kan ses. Nekrose, der spænder fra små områder af nekrotiske epitelceller af sekundære lameller til fuldstændig tab af lameller, observeres. Branchial epitelceller og leukocytter kan have fremtrædende nukleare hævelse, margination af kromatin til at give en “signet ring” udseende og bleg diffus eosinofile intranuklear indeslutninger er blevet observeret. Betændelse, nekrose og nukleare indeslutninger er blevet observeret (individuelt eller sammen) i andre organer, især nyrerne, men også i milten, bugspytkirtlen, leveren, hjernen, tarmen og oral epitel. 

c) Metoder til registrering og identifikation af agenter 

Detaljerede metoder præsenteres ikke her, fordi der ikke har været omfattende sammenligning og validering af detektions- og identifikationsmetoder for KHV. Der gives dog en kort beskrivelse af de tilgængelige offentliggjorte metoder. Metode reco mmendations vil afhænge af yderligere test og validering og yderligere data fra laboratorier, der har udviklet metoderne til at afgøre, om de er “egnet til formålet”. 

Direkte detektionsmetoder i) Isolering af KHV i cellekultur 

Virussen kan isoleres i et begrænset antal cellekulturer, men cellekulturisolation er ikke så følsom som PCR og anses ikke for at være en pålidelig diagnostisk metode til KHVD (15). 

Viruset replikerer i koi finceller (KF-1) (17), karpefinne (CaF-2) og karpehjerne (CCB) celler (24) og i primære celler fra finner af almindelig eller koi karpe (19, 26, 28). Andre cellelinjer, der rutinemæssigt anvendes til isolering af fiskepatogene vira som EPC, FHM, BF-2, CHSE214 og RTG-2-celler, er ildfaste for virusset (4, 19, 24, 37). Virus er mest rigelige i gill, nyre, og milt væv i løbet af åbenlys infektion (10), og det anbefales at prøve disse væv til virus isolation. Den optimale inkubationstemperatur for virusisolation i KF-1- eller CCB-celler er 20 °C, men der kan være behov for 8-12 dages inkubation, før der observeres en cytopatisk effekt (CPE) (7). 

ii) Identifikation af virus isoleret i cellekultur 

Vira, der er isoleret i cellekulturen, skal identificeres endeligt, da en række forskellige vira er blevet isoleret fra karper, der udviser kliniske tegn, der ligner KHVD’s (5, 15). 

Hurtige formodede metoder 

Immundiagnostiske metoder, der ligner dem, der anvendes til formodet identifikation af SVC
(f.eks. IF-test eller ELISA’er), kan meget vel være egnede til hurtig identifikation og diagnosticering af KHVD (27, 32). 

Bekræftende identifikationsmetoder 

Den mest pålidelige metode til bekræftende identifikation er ved PCR eller en af dens varianter, som også er blevet brugt til at identificere KHV DNA direkte i fiskevæv (2, 8-11, 13, 19, 20, 27, 40). 

En PCR baseret på thymidin kinase (TK) genet af KHV blev rapporteret at være mere følsomme end PCR metoder beskrevet af Gilad et al. (9) og Gray et al. (11), og kunne opdage 10 fg KHV DNA (2); PCR af Ishioka et al. (20), baseret på DNA polymerase genet, opdaget 100 fg KHV DNA. Den loop-medierede isotermiske forstærkningsmetode (LAMP) (13) var også baseret på KHV TK-genet og var lige så følsom som en PCR-metode udviklet af de samme forfattere, men var hurtigere end PCR. PCR beskrevet af Gray et al. (11) blev forbedret af Yuasa et al. (40), og er blevet indarbejdet i de officielle japanske retningslinjer for påvisning af KHV. Nye forbedrede diagnostiske PCR-test vil fortsat blive udviklet, og det er håbet, at de vil blive valideret som anbefalet i kapitel 1.1.3 i denne aquatic manual. De DNA-ekstraktions- og PCR-protokoller, der er beskrevet nedenfor til direkte påvisning af KHV i fiskevæv, er også velegnede til bekræftende identifikation af inficerede cellekultur supernatanter. 

iii) Diagnostiske metoder til klinisk syge fisk 

Direkte påvisning i fiskevæv 

KHV er blevet identificeret i berøringsaftryk af lever, nyre og hjerne af inficerede fisk af IF. De højeste niveauer af positiv immunfluorescence blev set i 

nyrerne og virusset kan påvises af IF på et nyreaftryk 1 dag efter infektion (27, 32). Virusantigen er også blevet påvist i inficeret væv ved hjælp af en immunoperoxidasefarvningsmetode. Virusantigen blev påvist ved 2 dage efter infektion i nyrerne og blev også observeret i gællerne og leveren (27). Påvisning af KHV ved immunstain skal dog fortolkes med forsigtighed, da positive farvningsceller kan skyldes krydsreaktion med serologisk relateret virus (f.eks. CyHV-1) eller et ikke-viralt protein (27). 

ELISA-baserede metoder til direkte påvisning af KHV-antigen i inficeret væv er under udvikling i en række laboratorier verden over, men der er ikke offentliggjort nogen metoder. 

Den mest anvendte metode til påvisning af KHV direkte i fiskevæv er ved hjælp af PCR-analyser, der er specifikke for KHV (se ovenfor under bekræftende identifikation). 

I undersøgelser udført på Cefas Weymouth laboratoriet blev offentliggjorte primersæt sammenlignet ved hjælp af en standard PCR-protokol til påvisning af KHV DNA i karpevæv (K. Way, ikke-offentliggjorte data). Primer sæt rettet mod TK genet (2) var den mest følsomme med en detektion grænse tre log større end Gilad primere. CNGV primere (27) og modificerede Grå SpH primere, der er rettet mod korte regioner af genomet (henholdsvis 109 bp og 151 bp), klarede sig også godt, især på nedbrudt væv. TK primer-sættet klarede sig senere godt i et metoderingsforsøg udført i 21 laboratorier i 19 lande rundt om i verden (K. Way, ikke-offentliggjorte data). 

Den samme undersøgelse på Cefas og metoderingsforsøget sammenlignede også kommercielle DNA-ekstraktionssæt for deres evne til at levere KHV DNA af tilstrækkelig kvalitet til PCR. Af de kommercielle kits testet på Cefas, EasyDNA (Invitrogen), DNeasy (Qiagen) og DNAzol reagens (Invitrogen) alle ekstraheret DNA af passende kvalitet. I ring-forsøget, High Pure PCR skabelon forberedelse kit (Roche), QIAamp DNA blod minikit (Qiagen) og Puregene DNA 

rensningssæt, alle klarede sig godt. Nogle laboratorier fandt imidlertid, at DNAzol-reagenset ikke var så pålideligt. 

Nedenstående prøveforberedelsesprotokol bruger DNAzol-reagenset til udvinding af KHV DNA. Dette er en nem at bruge, kort varighed protokol, der også er relativt billigt i forhold til nogle kits. Laboratorier, der ikke er bekendt med DNAzol udvinding kan finde metoden mindre pålidelig i deres hænder. En række DNA-ekstraktionssæt er dog tilgængelige kommercielt (herunder dem, der er anført ovenfor), der vil producere DNA af høj kvalitet, der er egnet til brug med PCR-protokollen detaljeret. 

Den PCR-protokol, der er beskrevet nedenfor, bruger TK-primeren, der er udviklet af Bercovier og kolleger på Hebrew University-Hadassah Medical School i Israel (2). Af de offentliggjorte single-round-PCR-metoder anses dette i øjeblikket for at være den mest følsomme til påvisning af KHV DNA i friske vævsprøver fra klinisk syge karper. Denne protokol kan også gøre det muligt at påeskrive subkliniske niveauer af virus. Hvis vævet viser tegn på nedbrydning derefter primer sæt (se ovenfor) rettet mod kortere regioner af genomet kan være nødvendigt at blive anvendt i stedet for TK primer sæt. 

Generelle bemærkninger 

PCR er tilbøjelig til falsk-positive og falsk-negative resultater. Derfor bør hver analyse og vævsudvinding omfatte en negativ kontrol for at udelukke forurening. For yderligere at minimere risikoen for kontaminering bør der anvendes aerosolforberedende pipettespidser til alle prøve- og PCR-reaktionspræparater. 

Prøveforberedelse 

i) Virusudvinding fra organvæv bør foretages efter proceduren i kapitel I.1 (afsnit B.3.2). 

ii) Der tilsættes 100 μl vævs homogenat (1/10 [w/v]) eller viruskultur supernatant til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, der indeholder 1 ml DNAZOL-reagens®. 

iii) Bland forsigtigt ved at vende røret fem gange og stå ved stuetemperatur i 5 minutter og derefter centrifuge ved 10.000 rpm i 10 minutter ved hjælp af en mikrocentrifuge. 

iv) 1 ml supernatanten fjernes til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugrør indeholdende 0,5 ml ethanol. 

v) Bland forsigtigt ved at vende røret fem gange og stå ved stuetemperatur i 5 minutter, og centrifuge ved 13.000 rpm i 30 minutter ved hjælp af en mikrocentrifuge. vi) Fjern supernatanten, og skyl pelleten med 250 μl 70% ethanol i molekylærbiologisk vand. vii) Spin prøver i 5 minutter ved 13.000 rpm. viii) Tag ethanolen af med en pipette og lufttørrer pelleten ved at lade rørene stå åbne på bænken i 5 minutter. 

ix) Resuspend pellet i 50 μl molekylærbiologi kvalitet vand, prewarmed ved 60 C, og inkuberes ved 60 C i 5 minutter. Prøver kan opbevares ved – 20 C, indtil det er nødvendigt. 

PCR 

Alle PCR-reaktioner fremstilles i et rent område, der er adskilt fra det område, hvor forstærkningerne udføres. Dette vil minimere risikoen for kontaminering. 

i) For hver prøve forberedes en masterblanding, der indeholder: For Go Taq Polymerase: 10 μl Reaktionsbuffer (×10 conc.) 5 μl MgCl2 (25 mM lager) 0,5 μl dNTPs (25 mM mix) [Promega Cat.no.U1240]
0,5 μl Forward primer (100 pmol/μl stock)
0,5 μl Reverse primer (100 pmol/μl stock) 

• 0,25 μl Go Taq polymerase 500 μ (5 μ/μl) [Promega Cat.no.M8305] 
• 30,75 μl Molekylærbiologi kvalitet vand 

Bercovier TK primere:
Forward = 5′-GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G-3’Reverse 
= 5′-CAC -CCA-GTA-GAT-TAT-GC-3’Produktstørrelse 
= 409 bpFor 
hver prøve dispenseres 47,5 μl i et 0,5 ml tyndtvægget mikrocentrifugrør. 

Overlay med to dråber mineralsk olie. 

ii) Tilsættes 2,5 μl af dna’et, der er udvundet DNAzol®. Opbevar resten af DNA’et ved -20oC. iii) Sæt rør i en termisk cycler og udfør program: 1 cyklus af: 5 minutter ved 94oC 40 cyklusser af: 1 minut ved 95oC 1 minut ved 55oC 1 minut ved 72oC Efterfulgt af en endelig forlængelse trin på 10 minutter ved 72oC. 

iv) Elektrophorese 20 μl mængder PCR-produkt på en 2% ethidiumbromid farvet agarosegel (4% ved adskillelse af mindre forstærkningsprodukter på <300 bp) ved 120 V i 20 minutter og visualiseres under UV-lys. En passende molekylvægtstige skal medtages på gelen for at bestemme produktets størrelse. 

v) Produkter af den korrekte størrelse skal bekræftes som KHV af oprindelse ved sekvensanalyse. 

4. Vurdering af test i forhold til brugsformål 

De metoder, der i øjeblikket er tilgængelige til overvågning, påvisning og diagnosticering af KHVD, er anført i tabel 1. De betegnelser, der anvendes i tabellen, angiver: A = metoden er i øjeblikket den anbefalede metode af hensyn til tilgængelighed, nytte- og diagnosefølsomhed og specificitet; B = metoden er en standardmetode med god diagnostisk følsomhed og specificitet; C = metoden har anvendelse i nogle situationer, men omkostninger, nøjagtighed eller andre faktorer alvorligt 

begrænser dens anvendelse D = metoden anbefales i øjeblikket ikke til dette formål. Selv om ikke alle de prøver, der er opført som kategori A eller B, har gennemgået formel standardisering og validering (i hvert fald trin 1 og 2 i kapitel 1 i kapitel 1.1.2), gør deres rutinemæssige karakter og det forhold, at de er blevet anvendt i vid udstrækning uden tvivlsomme resultater, dem acceptable. 

Tabel 1. KHVD-overvågning, detektions- og diagnostiske metoder 

Metode 

Grove tegn Histopatologi af væv og organer Isolering af i cellekultur Antistof-baserede assays til påvisning af KHV antigen (IFAT, ELISA) Transmission EM af væv 

PCR af vævsekstrakter*
PCR – sekvensanalyse Påvisning af KHV antistoffer i eksponeret fisk (ELISA)** 

Overvågning til formodede 
bekræftendeerklæring frihed fra diagnose af infektionsdiagnose 

Infektion 

infektion eller sygdom eller sygdom 

D B D D B C 

D C D D B C 

D B C 

C A A NA C A C C D 

IFAT = Indirekte fluorescerende antistoftest; ELISA = enzymbundet immunosorbentanalyse; EM = elektronmikroskopi; PCR = polymerase kædereaktion. 

*Diagnostiske virologer bør være opmærksomme på, at fisk, der for nylig er vaccineret mod KHV, kan testes positive af PCR. Der foreligger i øjeblikket ingen oplysninger, der indikerer nogen genomsekvensforskelle mellem den svækkede vaccinestamme og KHV(wild-type) KHV. Indtil disse sekvensoplysninger er givet, vil diagnostiske laboratorier ikke være i stand til at skelne mellem w.t. og vaccinestamme af KHV, og dette kan føre til en falsk diagnose. 

**Diagnostiske virologer skal være opmærksomme på, at fisk, der for nylig er vaccineret mod KHV, kan testes positive af ELISA. Der kan også være en lav-niveau krydsreaktion med antistoffer mod CyHV-1. 

BEMÆRK: Mange diagnostiske laboratorier kan have problemer med at opnå antistoffer mod KHV, der er egnede til brug i immundiagnostiske tests. Et begrænset antal monoklonale og polyklonale antistoffer kan dog meget snart fås fra kommercielle kilder. Det er meget sandsynligt, at diagnostiske kits også snart vil være tilgængelige fra de samme kilder. 

5. Bekræftende diagnostiske kriterier 

a) Definition af mistænkelig sag 

Et mistænkeligt tilfælde af KHVD defineres som tilstedeværelsen af typiske kliniske tegn på sygdommen i en population af modtagelige fisk eller præsentation af typisk histopatologi i vævsafsnit eller typisk CPE i cellekulturer uden identifikation af det forårsagende middel eller et enkelt positivt resultat fra en af de diagnostiske analyser, der er beskrevet ovenfor. 

b) Definition af bekræftet tilfælde 

Et bekræftet tilfælde defineres som et mistænkeligt tilfælde med efterfølgende identifikation af det forårsagende middel ved en af de serologiske eller molekylære analyser, der er beskrevet ovenfor, eller et andet positivt resultat fra en separat og anden diagnostisk analyse, der er beskrevet ovenfor. 

6. Diagnostiske/detektionsmetoder til at erklære frihed 

Der findes på nuværende tidspunkt ingen anbefalede metoder til overvågning af modtagelige fiskebestande med henblik på frierklæring fra KHV. Mange laboratorier undersøger imidlertid videreudviklingen af molekylære metoder for at øge følsomheden (f.eks. realtid og indlejret PCR) eller for pålideligt at opdage lave niveauer af vedvarende virus-DNA. Disse analyser kan meget vel vise sig egnede til overvågningsprogrammer.